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Efecto de reguladores de crecimiento en la embriogénesis somática del híbrido de café
Velazco-5
Growth regulators effect on the Velazco-5 coffee hybrid somatic embryogenesis
Autores: Ing. Dayamí Viltres-Barbán
(1)
, Dr.C. Jorge Liusvert Pérez-Pérez
(2)
, MSc Juan
Robles-Pastrana
(3)
Organismo:
(1)
Instituto Nacional Agroforestal III Frente Oriental, Santiago de Cuba, Cuba.
(2)
Universidad de Granma, Granma, Cuba.
(3)
Universidad de Guadalajara, Jalisco. México
E-mail: adiestrado4@tercerfrente.inaf.co.cu
Resumen
El cultivo in vitro de células y tejidos
vegetales desempeña un papel importante
en la biotecnología agrícola. Debido a la
importancia como cultivo que tiene el
cafeto en Cuba se realizó este trabajo en la
estación Agroforestal INAF, del municipio
III Frente Oriental de la provincia de
Santiago de Cuba. Con el objetivo de
evaluar el efecto de diferentes
concentraciones de Auxinas y Citoquininas
en la embriogénesis somática del híbrido
de café Velazco-5, se realizaron dos
ensayos biotecnológicos a nivel de
laboratorio para probar diferentes
concentraciones en la formación de callos
y la embriogénesis somática en café. Se
obtuvo que es posible obtener callogénesis
y embriogénesis somática en el cultivo de
café Velazco-5 con los reguladores de
crecimiento evaluados obteniendo hasta un
94, 13% de inducción de callos
embriogénicos.
Palabras clave: biotecnología agrícola;
café; reguladores de crecimiento;
embriogénesis somática
Abstract
In vitro culture of plant cells and tissues
plays an important role in agricultural
biotechnology. Due to the importance of
the coffee tree crop in Cuba, this work took
place at the INAF Agroforestry Station, in
the III Frente Oriental, municipality located
at Santiago de Cuba province. With the
objective of evaluating the effect of different
concentrations of auxins and cytokinins on
the somatic embryogenesis of the Velazco-
5 coffee hybrid, two biotechnological tests
were carried out at the laboratory level to
test different concentrations in the
formation of callus and somatic
embryogenesis in coffee. It was found that
it is possible to obtain calllogenesis and
somatic embryogenesis in the Velazco-5
coffee crop with the growth regulators
evaluated, obtaining up to 94.13%
induction of embryogenic callus.
Keywords: agricultural biotechnology;
coffee; growth regulators; somatic
embryogenesis
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Introducción
El café (Coffea spp.) es un cultivo de suma relevancia a nivel mundial por su alto valor como
bebida de consumo (Alemayehu, 2017) y por ser uno de los productos agrícolas más
importantes, ocupando el segundo puesto en el comercio internacional luego del petróleo
(Labouisse et al., 2008). Las regiones tropicales y subtropicales del mundo son los lugares
donde se cultiva mayormente, derivándose, directa o indirectamente de su producción, los
ingresos de más de 125 millones de personas (Tran et al., 2016).
El género Coffea L., comprende más de 130 especies, de las cuales las más cultivadas
comercialmente son C. arabica L., C. canephora P. y C. liberica Bull. Fernández et al.,
(2010). Coffea arabica L. es la especie más importante y la preferida en el mercado, teniendo
una participación promedio entre las cosechas 2014-2015 y 2015-2016 de 58,1 % en la
producción mundial (ICAFE, 2016).
Todas las especies de café, a excepción de Coffea arabica L., Coffea heterocalyx L. y Coffea
anthonyi L., son autoincompatibles y además C. arabica L. es la única especie no diploide. La
especie Arábica es un alotetraploide autofértil (2n=4x=44), producto de la hibridación
espontánea entre Coffea canephora Pierre (progenitor paterno) y Coffea eugenoides L
(progenitor materno) (Lashermes et al., 1999), con un tamaño de genoma de 1300 Mpb
(Lashermes et al., 2008).
Las diferentes ploidías en el género Coffea obstaculizan la introducción de características
agronómicas de las especies diploides hacia las tetraploides y por esto, es tan importante el
uso de técnicas que puedan romper estas barreras entre especies y que sirvan para
complementar los programas tradicionales de mejoramiento genético y, a la vez la base
genética disponible.
El mejoramiento del café y la obtención de un nuevo cultivar con base en las metodologías
tradicionales, es un proceso que requiere alrededor de treinta años (Melese, 2016) y
esfuerzos, ya que comprende varios pasos como la selección de las especies o variedades a
utilizar, su consiguiente hibridación y evaluación de la progenie resultante, en algunos casos
retrocruces, y cruces interespecíficos (Orozco y Schieder, 1982).
El cultivo in vitro de células y tejidos vegetales desempeña un papel importante en la
biotecnología agrícola. La embriogénesis somática como método de regeneración de plantas
se ha logrado en un gran número de familias y especies y se ha usado para los estudios
básicos de fisiología vegetal y en aplicaciones más prácticas, como la micropropagación y la
transformación genética.
En este sentido la embriogénesis somática es el método más estable, y consiste en el
desarrollo de los procesos por el cual células somáticas dan origen a un embrión somático
sin intervención de gametos (Mesén y Jiménez 2016). La embriogénesis somática fue
descrita por primera vez en Coffea canephora (var. Robusta) por Staritsky (1970) y Coffea
arabica en 1977 por Sondahl y Sharp, quienes describieron la inducción de embriones a
partir de callo.
La aplicación de la embriogénesis somática para la multiplicación acelerada de plantas de
café se ha desarrollado a partir de numerosas técnicas que simplifican este proceso que
busca establecer la producción de plantas de gran potencial y reducir los costos de
producción de posturas. Existen diversos trabajos que han descrito la embriogénesis
somática directa en café, esta vía de regeneración de plantas permite reducir el tiempo de
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cultivo, disminuye los costos de producción y reduce la frecuencia de variación somaclonal
respecto a la vía indirecta. Por otro lado, la embriogénesis somática directa con frecuencia es
descrita como de baja frecuencia y la vía indirecta como un método de alta frecuencia
(Etienne et al., 2016).
La gran cantidad de protocolos disponibles en la literatura, reflejan que el café no es una
especie con problemas para la embriogénesis somática. Sin embargo, se ha descrito una
gran variabilidad en la eficiencia de regeneración, esto ha sido debido a las diferencias que
muestran los genotipos incluso con empleo de un mismo protocolo.
Al respecto la literatura consultada plantea que los porcentajes de germinación de los
embriones somáticos no superan el 60% y no siempre se logra una germinación completa
(Barbón et al., 2014). Generalmente, es posible inducir embriogénesis somática en Coffea
canephora variedad Robusta, sólo con la presencia de la Citocinina 6-Benzilaminopurina
(BAP) en el medio de inducción.
Sin embargo, en algunos clones no se obtienen buenos resultados con este medio y en
ciertos casos el desarrollo de callo embriogénico es un proceso largo, que va de seis a diez
meses dependiendo del genotipo (López-Gómez et al., 2010; López-Gómez et al., 2011).
Teniendo en cuenta que el Velazco 5 es un híbrido interespecífico que solamente puede ser
propagado vegetativamente o con el empleo de técnicas biotecnológicas, se hace necesario
investigar combinaciones de Auxinas y Citoquininas que permitan establecer un protocolo
eficiente para obtener embriones somáticos y regenerar plantas de este híbrido
Objetivo: Evaluar el efecto de diferentes combinaciones de Auxinas y Citoquininas en la
embriogénesis somática del híbrido de café Velazco-5.
Materiales y métodos
La investigación se realizó en el laboratorio de biotecnología del Instituto de Investigaciones
Agroforestales, Tercer Frente, Santiago de Cuba, durante el período comprendido entre
diciembre del 2020 a septiembre del 2021.
Obtención de las vitroplantas
Como explante se tomaron hojas tiernas de plantas madres del híbrido de café Velazco -5,
que crecerán en aisladores biológicos. Las hojas se lavaron con agua estéril y se
sumergieron en una solución de etanol 70% por 30 segundos, luego se les adicionó una
solución al 2% NaOCl durante 30 min. Al finalizar las hojas se enjuagaron tres veces con
agua destilada estéril con Cisteína, luego fueron cortadas en segmentos de 1cm
2
, colocadas
en pomos de cristal con los medios de cultivo.
El medio de cultivo utilizado fue Murashige y Skoog (1962) (MS), suplementado con
Mioinositol 100 mg
.
L
-1
, sacarosa 30 g
.
L
-1
y solidificado con Agar Planta 8 g
.
L
-1
. En la fase de
multiplicación se suplementó el medio de cultivo con Bencilaminopurina (BAP) 4 mg
.
L
-1
y
ácido indolacético (AIA) 0,65 mg
.
L
-1
. En la fase de enraizamiento se suplementó con AIA 1
mg
.
L
-1
y AIB 1 mg
.
L
-1
. El pH del medio de cultivo fue ajustado a 5,7.
Los cultivos in vitro se mantuvieron en cámaras de crecimiento a temperatura de 25±1°C,
humedad relativa 60 %, iluminación de 23 µmol m
-2
s
-1
(flujo de fotones fotosintéticos) con
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lámparas de luz fluorescente, fotoperíodo 16 h luz y 8 h oscuridad. Estas serán ubicadas en
cámaras de crecimiento con un diseño completamente aleatorizado en condiciones
controladas de laboratorio y los datos se procesarán con el programa Statistic 8.0, se utilizará
la prueba de Duncan para comparar las medias, previa transformación de los datos X’ =
(arcsen √x).
Efecto de la concentración de Auxina 2,4-D y la Citoquinina 6-BAP en la inducción de
callos potencialmente embriogénicos del híbrido café Velazco-5.
Este experimento tuvo como objetivo determinar la influencia de concentraciones de la
Auxina 2,4-D y la Citoquinina 6-BAP en la inducción de callos potencialmente embriogénicos
del híbrido de café Velazco-5. Para la inducción callogénica se utilizaron segmentos de hojas
procedentes del híbrido de café Velazco-5, los mismos fueron colocados con el haz sobre el
medio de cultivo, durante cuatro semanas en condiciones de oscuridad a 25 ºC.
Se empleó el medio de cultivo propuesto por Hermoso y Menéndez (2000), constituido por
sales Murashige y Skoog (MS) 50%, 100 mg/l Mioinositol, 35 mg/l Cisteína, 10 mg/l Tiamina,
1 mg/l de Piridoxina, 1 mg/l de Ácido Nicotínico, 30 g/l Sacarosa y 2.4 g/l Gelrite, a pH de 5,8.
Este medio de cultivo fue enriquecido con diferentes concentraciones y reguladores de
crecimiento: 2,4-ácido Diclorofenoxiacético y Kinetina.
Tratamientos
T1
Sales MS + sin Hormonas (Control)
T2
3 mg.L
-1
de 6 BAP
T3
6 mg.L
-1
de 6 BAP
T4
8 mg.L
-1
de 6 BAP
T5
3 mg.L
-1
de 2,4D
T6
3 mg.L
-1
de 2,4D+3 mg.L
-1
de 6 BAP
T7
3 mg.L
-1
de 2,4D+6 mg.L
-1
de 6 BAP
T8
3 mg.L
-1
de 2,4D+8 mg.L
-1
de 6 BAP
T9
6 mg.L
-1
de 2,4D
T10
6 mg.L
-1
de 2,4D+3 mg.L
-1
de 6BAP
T11
6 mg.L
-1
de 2,4D+6 mg.L
-1
de 6BAP
T12
6 mg.L
-1
de 2,4D+8 mg.L
-1
de 6BAP
T13
8 mg.L
-1
de 2,4D
T14
8 mg.L
-1
de 2,4D+3 mg.L
-1
de 6BAP
T15
8 mg.L
-1
de 2,4D+6 mg.L
-1
de 6BAP
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T16
8 mg.L
-1
de 2,4D+8 mg.L
-1
de 6BAP
Se evaluó el número de explantes con formación de callo (%); color y textura de callo,
clasificados en friable o no friable, según lo planteado por (Ortiz et al., 2017).
Análisis estadístico
A partir de los datos obtenidos se realizó un análisis de varianza, para el modelo matemático
correspondiente a un diseño de bloques al azar. Se utilizó el Test de Comparación de
Rangos Múltiples de Duncan para un 95 %) para separar las medias (Duncan, 1995). Con
vista a llevar a cabo este procesamiento y análisis estadístico se utilizó el paquete
STATGRAPHICS PLUS versión 5.0.
Resultados y discusión
Efecto de la concentración de Auxina 2,4-D y la Citoquinina 6-BAP en la inducción de
callos potencialmente embriogénicos del híbrido café Velazco-5.
Con relación a la variable se muestra en la figura 1 que hubo diferencias significativas entre
los tratamientos donde destacan en la formación de callos los tratamientos T11, T10 y T12
respectivamente con un valor de inducción de callos que alcanza con el tratamiento T11 de
94,13% en el híbrido de café Velazco-5. Estos resultados pudieran estar causados por la
presencia de estimulante y su interacción con otras hormonas que regulan numerosas
funciones específicas de las células, así como la capacidad que tiene este producto de
provocar efectos beneficiosos atribuidos a la presencia de hormonas naturales y otros
compuestos que influyen en el crecimiento de las plantas.
Este comportamiento (figura 2) del incremento del crecimiento puede estar dado por la
acción del estimulante en la zona del punto de crecimiento de las plantas, donde es capaz de
activarse la división y el alargamiento celular mediante la actividad de sustancias de
crecimiento presente en las plantas, como las Auxinas, Giberelinas, Citoquininas, entre otras
(Vázquez y Torres, 2001).
No se observó explantes oxidados y con relación a ello, por su parte López-Gómez et al.
(2010) obtuvieron más del 50% de explantes oxidados al usar 3,5% NaOCl; Paredes et al.
(2013), realizaron la desinfección de hojas de café con 1,5% de NaOCl por 20 minutos y el
10% de los explantes presentaron oxidación. Estos resultados favorables se deben a la baja
concentración de NaOCl y tiempo de inmersión utilizados en el experimento. Además, se
tuvo en cuenta otras estrategias descritas por Azofeifa (2009) como el estado juvenil de las
hojas, las sales del medio de cultivo a la mitad de concentración y la incubación en
oscuridad.
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Figura 1. Efecto de la concentración de Auxina 2,4-D y la Citoquinina 6-BAP en la inducción
de callos potencialmente embriogénicos del híbrido de café Velazco-5
En investigaciones los tratamientos que indujo alta tasa de callogénesis fue T1 (88%), T3
(66%) y T2 (100%) para la variedad Castillo, Catuaí y Costa Rica 95, respectivamente; sin
embargo, no hubo diferencias estadísticas con los otros niveles de BAP pero sí con los
tratamientos con KIN (T4, T5 y T6). La embriogénesis somática directa no se caracteriza por
una formación de callos previa a la formación de embriones; a pesar de ello, se observaron
callos pequeños y no diferenciados con el borde del explante, por lo que se les denominaron
callos de cicatrización, reportado también por López-Gómez et al. (2016).
Figura 2. Progresión lineal de las diferentes concentraciones de Auxina 2,4-D y la Citoquinina
6-BAP en la inducción de callos potencialmente embriogénicos del híbrido de café Velazco-5
Respecto a la evaluación de callogénesis, todos los tratamientos (T7-T12) presentaron alta
tasa de formación de callos (92-100%), en las tres variedades, sin diferencias estadísticas
significativas. Autores afirman que la adición de la Auxina 2,4-D permite la inducción de callo,
así lo reportaron Paredes et al. (2013), López-Gómez et al. (2016), Montes-Cruz et al. (2017) y
Avila-Victor et al. (2018), al usar diferentes concentraciones de 2,4-D, solo o con una
Citoquinina, para obtener 100% de explantes con callogénesis en diferentes variedades de
café.
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Conclusiones
Los tratamientos T11; T10; T12 respectivamente los cuales se les aplicó diferentes
concentraciones de Auxina 2,4-D y la Citoquinina 6-BAP inducen callos potencialmente
embriogénicos en el híbrido de café Velazco-5
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